CRISPR 基因编辑

1987年，日本学者石野良纯（Yoshizumi Ishino）团队在分析大肠杆菌的碱性磷酸酶基因周边序列时，首次发现了一段由长度为29个碱基的重复序列与32个碱基的非重复间隔序列交替排列组成的奇特基因组结构，但当时并未明确其生物学功能。^{55Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs) in Escherichia colijournals.asm.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

2002年，西班牙微生物学家弗朗西斯科·莫伊卡（Francisco Mojica）正式将这类广泛存在于原核生物基因组中的重复序列命名为“成簇的规律间隔的短回文重复序列”，即CRISPR，同时首次提出该结构可能与原核生物的免疫防御机制相关。^{66CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studiesonlinelibrary.wiley.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

2005年，多个独立研究团队先后发现CRISPR序列中的间隔序列绝大多数来自于噬菌体、质粒等外源可移动遗传因子，为CRISPR参与原核生物获得性免疫的假说提供了关键的直接证据。^{77Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotesonlinelibrary.wiley.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

2007年，丹尼斯·维尔格诺（Dennis Vogtenstain）的研究团队在嗜热链球菌中通过实验直接证实，CRISPR系统可以靶向清除入侵的噬菌体，且宿主对特定噬菌体的抗性与CRISPR阵列中对应噬菌体序列的间隔子直接相关，完整验证了CRISPR-Cas是原核生物的适应性免疫系统。^{88CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotesscience.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

CRISPR-Cas系统是绝大多数古菌与近半数细菌所携带的适应性天然免疫系统，其核心功能是识别并降解入侵的噬菌体、质粒等外源遗传物质，为原核生物提供特异性的获得性免疫保护。^{1010The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9science.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

该天然免疫系统的作用过程可分为三个核心阶段：第一为适应阶段，宿主的Cas蛋白复合物识别入侵外源核酸的特定序列片段，将其整合到自身基因组的CRISPR阵列前导区下游，形成可遗传的新间隔序列；第二为表达阶段，CRISPR阵列被转录为长链前体CRISPR RNA（pre-crRNA），随后经过Cas核酸酶或宿主内源核糖核酸酶的加工，生成成熟的、带有单个间隔序列的crRNA；第三为干扰阶段，成熟crRNA引导Cas效应蛋白复合物靶向结合与间隔序列互补的外源核酸序列，通过核酸酶活性切割靶标分子，清除入侵的遗传物质。^{1010The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9science.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

不同类型的CRISPR-Cas天然免疫系统在效应分子组成与靶标偏好上存在显著分化：第1类系统依赖多亚基的Cas蛋白复合物完成靶向识别与切割，多数仅靶向双链DNA；第2类系统则由单一效应蛋白即可完成核心功能，其中II-A亚型的Cas9蛋白天然具备同时靶向双链DNA的活性，也是后续被改造为主流基因编辑工具的核心天然元件。^{1010The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9science.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

天然CRISPR-Cas系统识别靶标序列时，除了依赖crRNA与靶序列的碱基互补配对之外，还需要靶序列侧翼存在被称为前间区序列邻近基序（PAM）的特定短序列，该特征是原核生物区分自身CRISPR阵列内的间隔序列与真正入侵的外源核酸、避免发生自身免疫攻击的关键分子机制。^{1010The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9science.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

1987年，日本学者石野良纯团队在分析大肠杆菌的碱性磷酸酶基因侧翼序列时，首次发现了成簇的、间隔短回文重复序列（CRISPR）的特殊结构，但当时并未明确其生物学功能。^{55Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs) in Escherichia colijournals.asm.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

2005年，多个独立研究团队通过生物信息学分析发现，CRISPR的间隔序列片段与噬菌体、质粒等外源遗传物质的序列高度同源，首次提出CRISPR可能与原核生物的适应性免疫防御机制相关的猜想。^{1111CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studiesonlinelibrary.wiley.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

2007年，丹麦食品科技公司丹尼斯克（Danisco）的鲁道夫·巴朗格团队通过针对嗜热链球菌的实验证实，CRISPR系统可以通过整合外源噬菌体的DNA片段作为间隔序列，赋予细菌对应噬菌体的抗性，直接实证了CRISPR是原核生物的适应性免疫系统。^{88CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotesscience.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

2010-2011年间，研究人员明确了II-A型CRISPR-Cas9系统的核心工作组件：除CRISPR RNA（crRNA）之外，还需要反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）参与Cas9核酸酶的激活和靶序列识别过程。^{1212The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNAnature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

2012年，埃玛纽埃尔·沙尔庞捷与珍妮弗·杜德纳的合作团队在《科学》发表论文，证明可以将crRNA与tracrRNA人工融合为单链向导RNA（sgRNA），仅通过调整sgRNA的5'端序列即可引导Cas9核酸酶在任意指定的DNA位点完成精准双链切割，首次完成了将细菌免疫防御工具改造为可编程基因编辑工具的核心概念验证。^{22A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunityscience.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

将CRISPR从免疫防御工具转化为基因编辑工具的核心转化思路，本质是把原核生物中识别外源入侵核酸的序列靶向机制，重定向为识别研究者指定的任意基因组位点，从而实现对真核生物基因组序列的定向改造，该思路也为后续各类CRISPR变体如碱基编辑、先导编辑的开发提供了底层逻辑框架。^{1010The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9science.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

向导RNA（gRNA）的天然原型是CRISPR系统中由CRISPR RNA（crRNA）和反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）通过碱基互补配对形成的二元RNA复合体，人工改造的单向导RNA（sgRNA）将二者的核心功能域融合为一条单链RNA，大幅简化了实验操作流程。^{1010The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9science.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

gRNA的5'端前20个核苷酸构成的靶向识别区，负责通过沃森-克里克碱基互补配对原则，结合靶标DNA上的同源序列，该区域的序列特异性是CRISPR系统实现定点靶向的核心基础。^{1010The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9science.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

靶标DNA上紧邻gRNA互补序列3'端的PAM（原间隔邻近基序）序列是Cas蛋白识别结合的必需条件，以应用最广泛的酿脓链球菌Cas9（SpCas9）为例，其识别的经典PAM序列为5'-NGG-3'，不存在该PAM序列的基因组位点无法被SpCas9系统有效靶向。^{1010The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9science.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

gRNA的3'端骨架区域负责形成特定的茎环二级结构，与Cas效应蛋白的带正电凹槽结合，引导Cas蛋白发生构象激活，只有当gRNA与靶DNA完成正确互补配对后，Cas蛋白的核酸酶结构域才会切换为活性状态，完成对靶标DNA双链的切割。^{1010The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9science.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

针对不同CRISPR变体系统，gRNA的长度、骨架结构、PAM匹配要求存在显著差异，例如Cas12a系统的gRNA不需要tracrRNA同源序列，其靶向识别区长度约为23-25nt，识别的PAM序列位于靶标互补序列的5'端，为5'-TTTN-3'。^{1515Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas systemcell.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

Cas9 核酸酶属于II型CRISPR系统的效应蛋白，天然状态下需要与crRNA和tracrRNA形成二元RNA引导的核糖核蛋白复合物后才具备DNA切割活性，其蛋白结构包含两个独立的核酸酶结构域：HNH结构域负责切割与引导RNA互补的DNA链，RuvC结构域负责切割非互补的DNA链。^{1010The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9science.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

Cas核酸酶完成精准DNA切割的必要前提是靶DNA序列下游存在PAM（原间隔序列邻近基序）短序列，以最常用的酿脓链球菌来源的SpCas9为例，其识别的PAM序列为5'-NGG-3'，只有靶位点紧邻该序列时Cas9才能完成后续的DNA解旋与结合过程。^{1010The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9science.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

当Cas9复合物结合到匹配的靶序列后，HNH结构域会在PAM序列上游约3个碱基的位置切割互补链，RuvC结构域则在对应位置切割非互补链，最终在靶DNA上产生平末端的双链断裂（DSB）。^{1010The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9science.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

CRISPR-Cas系统在真核细胞基因组特定位置诱导产生DNA双链断裂（DSB）后，细胞自身的内源性DNA损伤修复通路会启动修复过程，这是CRISPR实现不同基因编辑效果的核心分子基础。^{1616The DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editingsciencedirect.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

非同源末端连接（Non-Homologous End Joining, NHEJ）是真核细胞中占主导地位的DSB修复通路，可在无同源修复模板的情况下直接将断裂的DNA两端连接起来，该过程常伴随碱基的随机插入或缺失（indel），最终导致靶位点处的基因发生移码突变而实现基因敲除效果。^{1616The DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editingsciencedirect.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

同源定向修复（Homology-Directed Repair, HDR）是仅在细胞周期的S/G2期活跃的高保真DSB修复通路，当体系中存在与断裂位点侧翼序列同源的外源DNA模板时，细胞可利用该模板完成断裂位点的精准序列替换或插入，实现CRISPR介导的精准基因敲入或位点特异性碱基修正。^{1616The DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editingsciencedirect.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

NHEJ通路根据参与核心蛋白的差异可进一步分为经典非同源末端连接（c-NHEJ）和替代性非同源末端连接（alt-NHEJ）两个亚类，其中alt-NHEJ更容易引发染色体易位等大规模基因组结构变异，是CRISPR编辑安全性评估的重要关注靶点之一。^{1616The DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editingsciencedirect.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

经典CRISPR-Cas9系统是首个被成功改造并应用于真核细胞基因组编辑的II-A型CRISPR系统，其天然来源为酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的获得性免疫系统，该系统通过人工简化为仅需单条向导RNA（gRNA）与Cas9核酸酶两个核心组分即可完成靶向DNA切割的编辑工具。^{22A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunityscience.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

经典CRISPR-Cas9系统的靶向识别依赖基因组靶序列3'端的NGG基序，即原间隔邻近基序（PAM），该PAM序列的存在是Cas9核酸酶完成DNA双链切割的必要前提，这一特性也直接限定了经典SpCas9在基因组上的可编辑位点密度。^{22A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunityscience.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

经典CRISPR-Cas9系统介导的DNA切割会产生平末端的双链断裂（DSB），该断裂在真核细胞内主要通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）两条内源性通路完成修复，其中NHEJ通路通常会引入随机的小片段插入或缺失，实现基因敲除效果，而HDR通路可在提供外源同源模板的情况下实现精准的位点定向突变或序列插入。^{22A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunityscience.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

经典CRISPR-Cas9系统的核心组分SpCas9天然蛋白分子量约为160kDa，编码其全长序列的cDNA长度接近4.2kb，这一尺寸限制了其与其他功能元件共同装载到容量有限的腺相关病毒（AAV）载体中进行体内递送的效率，这也成为后续小型化Cas9变体开发的核心动因之一。^{22A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunityscience.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

Cas12a（旧称Cpf1）是2015年由张锋团队首次在弗朗西斯氏菌（Francisella novicida）等物种中发现的V-A型CRISPR相关核酸酶，与经典Cas9同属Class 2类CRISPR系统，但具有不同的结构与作用特性。^{1717Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas systemcell.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

与Cas9切割后产生平末端不同，Cas12a靶向识别PAM序列（通常为TTTV）后，切割靶DNA会产生4-5个核苷酸长度的5'突出粘性末端，该特性更利于定向DNA片段的无缝插入连接，在精准基因敲入场景下具备独特优势。^{1717Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas systemcell.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

Cas12a仅需要单一的crRNA即可完成靶向识别与切割，无需Cas9系统所需的tracrRNA组分，其crRNA设计长度更短，同时Cas12a具备自加工前体crRNA的能力，可在同一转录本上串联排布多个crRNA实现多基因位点同步编辑，简化了多靶点编辑的载体构建流程。^{1717Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas systemcell.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

Cas13是2016年由张锋团队发现的Class 2类VI型CRISPR相关核酸酶，天然靶向结合并切割RNA分子，不作用于双链DNA，是CRISPR家族中少见的RNA靶向编辑工具。^{1818C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effectorscience.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

Cas13家族包含Cas13a（旧称C2c2）、Cas13b、Cas13c、Cas13d等多个亚型，其中Cas13a在特异性切割靶标RNA之后，会激活非特异性的单链RNA旁切活性，可将体系内所有游离的单链RNA分子切碎，该特性是SHERLOCK等高灵敏度核酸检测技术的核心原理。^{1818C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effectorscience.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

碱基编辑（Base Editing）技术由哈佛大学博德研究所的刘如谦（David R. Liu）团队于2016年首次正式发表，该技术在不诱导双链DNA断裂（DSB）的前提下，将CRISPR系统的Cas9蛋白改造为失去核酸内切酶活性的dCas9，再与胞嘧啶脱氨酶结构域融合，实现靶向的C→T单碱基精准转换，突破了传统CRISPR依赖同源定向修复（HDR）进行单碱基编辑效率低、易引入随机插入缺失的局限。^{1414Direct observation of target search and discrimination by CRISPR-Cas9 at single-molecule resolutionnature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

初代胞嘧啶碱基编辑器CBE（Cytosine Base Editor）的原型为BE3，其编辑窗口通常覆盖sgRNA序列上的第4至第8位碱基（从PAM远端端开始计数），在哺乳动物细胞中实现C→T转换的效率普遍可达15%-75%，远高于同期传统CRISPR介导的HDR单碱基编辑效率。^{1414Direct observation of target search and discrimination by CRISPR-Cas9 at single-molecule resolutionnature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

在初代CBE发布后不到一年，刘如谦团队又开发出腺嘌呤碱基编辑器ABE（Adenine Base Editor），通过定向进化改造出可作用于DNA的腺嘌呤脱氨酶，实现了无需DNA双链断裂的A→G精准单碱基转换，覆盖了人类已知致病变异中约半数的单核苷酸多态性突变类型的修正需求。^{1919Adenine base editors catalyze A-to-G changes in genomic DNAnature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

先导编辑（Prime Editing）是由哈佛大学刘如谦团队于2019年首次正式发表的CRISPR衍生精准基因编辑技术，核心设计思路是摆脱传统同源定向修复（HDR）的依赖，通过融合逆转录酶功能的工程化Cas9切口酶与专门设计的先导编辑向导RNA（pegRNA）实现对目标基因组位点的精准改写。^{2121Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNAnature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

先导编辑的核心功能组件包含三个核心部分：一是经过改造、仅切割DNA单链的Cas9切口酶（通常为H840A突变体），二是与该切口酶融合表达的莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（M-MLV RT）工程化变体，三是同时携带靶位点识别序列、引物结合位点（PBS）以及包含预期编辑序列的逆转录模板的pegRNA分子。^{2121Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNAnature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

初代先导编辑系统（PE1）的基础编辑效率在人类多种细胞系中处于较低水平，后续通过优化逆转录酶的连接方式与蛋白序列得到的PE2系统，将精准编辑的整体效率相比PE1提升了数倍，大幅拓展了技术的实用场景。^{2121Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNAnature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

在PE2的基础上，研究团队进一步引入第二条可靶向非编辑链、引导其被Cas9切口酶切割的普通sgRNA，开发出PE3系统，通过诱导细胞对非编辑链的错配修复过程进一步提升了最终获得纯合精准编辑结果的概率，部分位点的编辑效率相比PE2实现了进一步提升。^{2121Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNAnature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

先导编辑技术理论上可实现的精准基因修饰覆盖范围远超传统碱基编辑器，既可以完成所有12种类型的单碱基替换，也能精准插入最长可达数十个碱基的外源序列、删除指定长度的内源基因组片段，还可同步在同一位点完成多类组合式的序列改写。^{2121Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNAnature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

先导编辑技术的出现填补了此前CRISPR技术体系中难以高效、精准完成长片段精准插入/删除的技术空白，被认为是继第一代CRISPR-Cas9核酸酶、碱基编辑器之后的第三代核心CRISPR精准编辑技术分支，为数千种此前难以通过碱基编辑器修正的人类致病基因突变提供了潜在的治疗路径。^{2121Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNAnature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

CRISPRi（CRISPR干扰）与CRISPRa（CRISPR激活）系统的核心构建基础是将天然Cas9蛋白的核酸酶结构域引入双点突变，生成失去DNA切割活性的dCas9（dead Cas9）蛋白，该蛋白仍可在sgRNA引导下精准靶向特定基因组位点，仅保留结合DNA的能力。^{2222Genome-scale transcriptional activation by a CRISPR-Cas9-based synergistic activation mediatornature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

CRISPRi系统的初代设计无需额外融合功能结构域，仅依靠dCas9结合到靶基因的启动子区域或转录起始位点下游的编码区，即可通过物理空间位阻效应阻挡RNA聚合酶的招募或转录延伸过程，实现靶基因的可逆、特异性转录抑制。^{2222Genome-scale transcriptional activation by a CRISPR-Cas9-based synergistic activation mediatornature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

后续优化的CRISPRi系统将dCas9与KRAB（Krüppel相关盒）转录抑制结构域融合，大幅提升了转录抑制的效率，相比初代仅靠空间位阻的版本，对哺乳动物细胞内靶基因的沉默效率可提升数倍至数十倍，同时降低了非特异性干扰的概率。^{2222Genome-scale transcriptional activation by a CRISPR-Cas9-based synergistic activation mediatornature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

初代CRISPRa系统采用直接将dCas9与单个转录激活结构域（如VP64）融合的设计，但该方案对多数内源基因的激活幅度有限，难以实现靶基因的高水平过表达。^{2222Genome-scale transcriptional activation by a CRISPR-Cas9-based synergistic activation mediatornature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

为提升激活效率，后续研究开发出SunTag、SAM（协同激活介质）等新一代CRISPRa架构：其中SAM系统通过在sgRNA骨架上添加MS2 RNA适配体序列，招募多个携带VP64、p65、HSF1激活结构域的融合蛋白，可在单个靶位点上组装多组分激活复合物，实现对内源基因的强转录激活。^{2222Genome-scale transcriptional activation by a CRISPR-Cas9-based synergistic activation mediatornature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

CRISPRi/CRISPRa系统无需引入基因组DNA双链断裂，相比传统的CRISPR切割编辑系统，大幅降低了细胞发生染色体易位、大片段缺失等有害基因组变异的风险，因此被广泛应用于全基因组规模的功能基因筛选研究。^{2222Genome-scale transcriptional activation by a CRISPR-Cas9-based synergistic activation mediatornature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

基于dCas9的调控框架后续进一步衍生出融合表观遗传修饰酶的变体，例如将dCas9与DNA甲基转移酶、组蛋白乙酰转移酶融合，可实现对靶位点表观基因组状态的定向改写，拓展了CRISPRi/CRISPRa技术的应用边界。^{2222Genome-scale transcriptional activation by a CRISPR-Cas9-based synergistic activation mediatornature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

靶向位点设计的第一步是明确目标编辑类型，包括基因敲除、碱基替换、片段插入或长片段删除等，不同编辑类型对gRNA的位置、PAM序列选择的要求存在显著差异，常规需优先选择位于目标功能结构域编码区、且PAM序列为5'-NGG-3'的SpCas9识别位点。^{2323CRISPR 基因编辑通用实验指南addgene.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

gRNA设计阶段必须通过全基因组序列比对完成潜在脱靶位点的预测，主流工具会同时统计错配碱基容忍度、染色质开放区域覆盖度等参数，优先选择特异性评分排名靠前、GC含量在40%-60%区间的候选位点，以平衡编辑效率与脱靶风险。^{2323CRISPR 基因编辑通用实验指南addgene.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

完成位点序列筛选后，实验室常规gRNA构建流程通常采用将正向、反向互补的寡核苷酸引物进行退火形成双链，再通过经典分子克隆方法插入到携带Cas9表达框与gRNA骨架序列的质粒载体中，后续通过Sanger测序验证插入序列完全匹配设计的靶向序列，即可获得可用于后续转染的重组gRNA表达载体。^{2323CRISPR 基因编辑通用实验指南addgene.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

对于部分需要快速获得gRNA的实验场景，也可选择体外转录的方式直接合成成熟gRNA，无需构建质粒载体，该方法可大幅缩短实验周期，同时更适用于核糖核蛋白复合物（RNP）递送的编辑体系。^{2323CRISPR 基因编辑通用实验指南addgene.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

CRISPR 实验室操作中核糖核蛋白（RNP）递送的常规流程，首先是在体外将纯化的Cas核酸酶蛋白与化学合成的sgRNA按预设摩尔比（通常为1:1.2至1:2）混合，在室温或37℃条件下孵育10至30分钟完成复合物组装，该步骤可避免质粒载体转录翻译过程带来的延迟与额外免疫刺激风险。^{2323CRISPR 基因编辑通用实验指南addgene.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

针对不同细胞类型，RNP递送可选择对应的物理或化学介导方式：对悬浮细胞常用电穿孔法，对贴壁培养的哺乳动物细胞可采用脂质体转染试剂介导的递送，对原代细胞或难转染细胞也可结合核转仪实现更高的入核效率，该类递送方式的编辑起效时间通常在递送后24至48小时即可检测到。^{2323CRISPR 基因编辑通用实验指南addgene.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

CRISPR表达载体递送的常规操作，首先是将编码Cas核酸酶的序列与sgRNA表达框组装至质粒、慢病毒载体或腺相关病毒（AAV）载体骨架中，经测序验证序列完全正确后，通过质粒大提获取高纯度无内毒素质粒，再根据实验体系选择转染或病毒包装后感染的方式导入靶细胞。^{2323CRISPR 基因编辑通用实验指南addgene.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

完成RNP或表达载体递送后的常规质控步骤，通常会在递送后48至72小时提取细胞基因组DNA，通过T7E1错配酶酶切实验或靶向测序验证靶位点的编辑效率，同时设置未递送任何编辑组分的阴性对照组排除内源基因组变异的干扰。^{2323CRISPR 基因编辑通用实验指南addgene.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

CRISPR 编辑效率验证的第一步通常是在转染/转导后48至72小时提取细胞基因组DNA，针对靶向位点区域设计特异性引物进行PCR扩增，获得覆盖编辑靶点的扩增子片段，为后续基因型分析提供模板。^{2323CRISPR 基因编辑通用实验指南addgene.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

T7E1错配核酸酶检测是实验室早期评估CRISPR批量编辑效率的经典方法，该酶可识别并切割异源双链中存在的错配位点，通过琼脂糖凝胶电泳条带灰度分析可粗略计算样本的整体插入缺失（indel）效率。^{2323CRISPR 基因编辑通用实验指南addgene.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

当混编细胞群的整体编辑效率达到实验预期阈值后，研究人员通常采用有限稀释法将细胞接种至96孔板，控制每孔平均接种细胞数为0.5至1个，以尽可能保证后续形成的细胞集落来源于单个细胞。^{2323CRISPR 基因编辑通用实验指南addgene.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

单克隆细胞生长至可传代规模后，需对每个候选克隆分别进行基因组DNA提取、靶点区域PCR扩增与基因型鉴定，区分纯合敲除、杂合编辑、未编辑以及存在大片段插入缺失的不同基因型克隆。^{2323CRISPR 基因编辑通用实验指南addgene.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

针对需进行精准位点敲入的实验体系，在基因型验证阶段还需通过跨边界PCR验证外源插入片段的定点整合情况，排除随机整合的假阳性克隆，确保后续实验的基因型背景纯一。^{2323CRISPR 基因编辑通用实验指南addgene.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

CRISPR 全基因组功能基因筛选文库是基于 CRISPR-Cas9 系统构建的高通量靶向文库，通过在全基因组范围内覆盖数千至数万个基因的靶向sgRNA序列，可一次性实现对细胞内几乎所有蛋白编码基因的功能扰动筛选，大幅提升了功能基因组学研究的通量与效率。^{2424Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cellsscience.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

目前主流的CRISPR全基因组筛选文库主要分为三类：CRISPR敲除文库（GeCKO系列）、CRISPR激活文库（CRISPRa）和CRISPR干扰文库（CRISPRi），分别实现基因的功能缺失、功能获得和表达下调三种不同的基因扰动效果，覆盖不同的功能筛选场景。^{2424Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cellsscience.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

2014年张锋团队发布的第一代人类全基因组CRISPR敲除文库GeCKO v2，覆盖了人类基因组中20611个蛋白编码基因，每个基因对应设计了6条独立的sgRNA，为后续大规模功能筛选研究提供了标准化的核心工具。^{2424Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cellsscience.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

CRISPR全基因组功能筛选文库已被广泛应用于药物靶点发现、病毒宿主关键基因鉴定、肿瘤耐药机制解析等生命科学基础研究场景，例如通过该类文库筛选已成功鉴定出多个针对化疗药物、靶向药物的全新耐药相关基因。^{2424Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cellsscience.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

CRISPR-Cas9系统大幅降低了模式生物基因修饰品系的构建门槛，相较于传统的锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）技术，其设计流程更简便、靶向成本更低，已成为几乎所有主流模式生物定制基因编辑品系的主流工具。^{2525Applications of CRISPR-Cas9 in genome engineering of model organismsnature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

针对经典模式生物小鼠，基于CRISPR的原核注射方案可直接在受精卵中实现目标基因的敲除或精准敲入，无需经过传统的胚胎干细胞打靶筛选步骤，将纯合突变品系的构建周期从1~2年压缩至3~6个月。^{2525Applications of CRISPR-Cas9 in genome engineering of model organismsnature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

CRISPR技术支持在多类非传统模式生物中实现可稳定遗传的基因修饰，此前因缺乏成熟遗传操作工具难以开展功能研究的物种，如斑马鱼、黑腹果蝇、秀丽隐杆线虫、拟南芥之外的特色植物品系等，均已通过该技术获得了大量定制化突变体资源。^{2525Applications of CRISPR-Cas9 in genome engineering of model organismsnature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

依托CRISPR构建的全基因组规模模式生物突变体库，如全基因敲除小鼠文库、全基因组靶向干扰果蝇文库等，为系统解析基因功能、筛选疾病相关靶点提供了覆盖度极高的遗传资源平台，大幅推动了功能基因组学领域的研究进展。^{2525Applications of CRISPR-Cas9 in genome engineering of model organismsnature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

CRISPR-Cas9 介导的全基因组 sgRNA 文库筛选体系首次实现了在哺乳动物细胞中以单碱基分辨率对海量基因功能位点进行平行高通量验证，突破了此前 RNAi 技术存在的脱靶率高、敲低不完全的技术瓶颈，将功能基因组筛选的覆盖度与信噪比提升了一个数量级以上。^{2626Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cellsscience.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

基于 CRISPR 的饱和突变筛选策略可针对特定基因的全部外显子区域或非编码调控区域设计覆盖所有潜在单核苷酸变异的 sgRNA 文库，系统性定位决定蛋白功能、药物敏感性的关键氨基酸位点以及增强子、沉默子等非编码功能元件，该方法已被广泛应用于肿瘤驱动突变的功能验证研究中。^{2626Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cellsscience.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

结合 碱基编辑 技术的 CRISPR 功能位点验证体系无需诱导 DNA 双链断裂，可直接在活细胞中精准引入所有类型的单核苷酸替换，实现对人类基因组中数十万种临床意义不明的变异（VUS）的快速功能注释，为 精准医学 领域的变异致病性判定提供了核心技术支撑。^{2626Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cellsscience.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

利用CRISPR-Cas9靶向敲除小麦中的MLO基因的三个同源拷贝，可获得对白粉病具有广谱抗性的小麦品种，该研究于2014年由中国科学院遗传与发育生物学研究所团队完成，是全球首个通过CRISPR编辑获得的抗白粉病小麦材料。^{2727CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in hexaploid bread wheat confers broad-spectrum resistance to powdery mildewnature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

通过CRISPR基因编辑修饰水稻的OsSWEET13基因启动子区域，可阻断白叶枯病菌分泌的效应蛋白结合，从而赋予水稻对白叶枯病的抗性，该编辑策略无需引入外源功能基因，仅对内源靶位点进行精准突变。^{2727CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in hexaploid bread wheat confers broad-spectrum resistance to powdery mildewnature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

2021年美国农业部已批准通过CRISPR编辑的抗褐变高GABA番茄上市，该品种通过敲除调控多酚氧化酶的基因减少采后褐变损耗，同时定向提升γ-氨基丁酸含量，兼具耐储运与营养强化特性。^{2929USDA confirms CRISPR-edited tomato is not subject to GMO regulationreuters.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

美国农业部（USDA）在2018年发布的监管框架中明确，仅通过CRISPR基因编辑引入、且可通过传统自然诱变手段获得的相似农产品，无需按照转基因生物（GMO）进行额外的严格审批流程，大幅降低了这类编辑作物的商业化门槛。^{3030USDA Announces New Regulatory Framework for Biotechnology Productsusda.gov前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

截至2024年，全球范围内已有超过20种由CRISPR技术编辑的农产品进入商业化种植或上市销售阶段，覆盖高营养作物、抗逆作物、特色风味作物等多个品类，其中包括抗褐变CRISPR编辑蘑菇、双低油菜籽改良品种等代表性产品。^{3232Global Status of Genome Edited Crops 2024isaaa.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

2016年，中国四川大学华西医院启动全球首项CRISPR体细胞编辑治疗人类疾病的临床试验，受试者为经标准治疗无效的晚期非小细胞肺癌患者，试验通过CRISPR技术编辑患者T细胞中的PD-1基因后回输，以增强抗肿瘤免疫应答。^{3333CRISPR-edited T cells in patients with refractory non-small-cell lung cancernature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

2020年，CRISPR Therapeutics与Vertex Pharmaceuticals联合开发的exagamglogene autotemcel（商品名Casgevy）完成针对镰状细胞病的关键性临床试验，结果显示接受治疗的患者在随访12个月后均未出现血管闭塞性危象，该疗法通过体外编辑患者自体CD34+造血干细胞的BCL11A红系增强子位点，重新激活胎儿血红蛋白表达。^{3434Exagamglogene Autotemcel for Transfusion-Dependent β-Thalassemianejm.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

针对转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR）的在体CRISPR编辑疗法NTLA-2001（商品名NTLA-2001）的1期临床试验结果显示，单次静脉输注后受试者血清转甲状腺素蛋白水平呈现剂量依赖性下降，最高剂量组的平均下降幅度可达90%以上，且随访28天内未报告严重不良事件。^{3535CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosisnejm.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

截至2024年，全球范围内已有超过20项针对单基因遗传病的CRISPR体细胞编辑临床试验进入2期及以后阶段，覆盖的适应症包括β-地中海贫血、先天性黑蒙症10型、血友病B等，其中针对β-地中海贫血的Casgevy也已获得欧盟与美国FDA的批准上市。^{3636CRISPR Clinical Trials Tracker 2024broadinstitute.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

2016年，中国四川大学华西医院团队启动了全球首例CRISPR编辑T细胞治疗晚期非小细胞肺癌的人体临床试验，该试验将CRISPR用于敲除T细胞表面的PD-1基因，以解除肿瘤微环境对免疫细胞的抑制作用。^{3737第一例CRISPR基因编辑人体试验：治疗肺癌nature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

截至2024年，全球范围内已有超过60项登记在册的临床试验使用CRISPR技术编辑免疫细胞开展癌症治疗研究，覆盖血液肿瘤、实体瘤等超过15种不同的癌症适应症。^{3939CRISPR基因编辑临床试验全球登记统计报告2024clinicaltrials.gov前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

CRISPR-Cas9 系统的脱靶效应核心产生机制之一是向导RNA（gRNA）与基因组非靶向位点存在错配容忍度，即当非靶向位点与gRNA的原间隔序列邻近基序（PAM）匹配、且间隔序列上存在至多3个碱基错配时，Cas9核酸酶仍可能识别并切割该位点，引入非预期的DNA双链断裂。^{4040DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleasesnature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

除了碱基错配容忍度外，CRISPR脱靶的另一类重要产生机制是gRNA与非靶向位点间形成的“凸起”结构，即gRNA或靶DNA链上存在未配对的碱基环，这种非完全互补的结构仍可被Cas9识别并触发切割。^{4040DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleasesnature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

GUIDE-seq技术通过将双链寡核苷酸标签（dsODN）整合到细胞内CRISPR诱导的DNA双链断裂位点中，后续通过定向扩增和测序富集脱靶位点序列，其检测灵敏度显著高于早期全基因组测序方法，可捕捉到发生频率低至0.1%的脱靶事件。^{4141GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target DSBs induced by CRISPR-Cas nucleasesnature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

高保真Cas变体的初代优化方向集中于破坏SpCas9非特异性DNA互作的关键残基，通过点突变削弱Cas9蛋白与非靶标DNA骨架、错配碱基对的静电结合能力，代表变体SpCas9-HF1将全基因组脱靶事件降低至接近本底检测水平，同时保留了90%以上的靶向编辑活性。^{1414Direct observation of target search and discrimination by CRISPR-Cas9 at single-molecule resolutionnature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

后续优化方向拓展至重塑Cas9蛋白的PAM结合口袋与核酸识别构象动态，通过定向进化或理性设计获得的eSpCas9、HypaCas9等变体，在维持NGG经典PAM识别偏好的前提下，进一步提升了对单碱基错配靶序列的区分阈值，部分变体的脱靶信号较野生型SpCas9降低超过1000倍。^{1414Direct observation of target search and discrimination by CRISPR-Cas9 at single-molecule resolutionnature.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

CRISPR Therapeutics 由CRISPR技术核心发明人埃玛纽埃尔·沙尔庞捷于2013年联合创立，是全球首批专注于CRISPR基因编辑临床转化的生物技术企业，其核心管线exa-cel（商品名Casgevy）于2023年获英国药品和医疗产品监管局批准，成为全球首款正式上市的CRISPR基因编辑疗法，用于治疗镰状细胞病和β-地中海贫血。^{4343CRISPR Therapeutics Announces UK MHRA Approval of Casgevy (exagamglogene autotemcel) for the Treatment of Sickle Cell Disease and Beta-Thalassemiair.crisprtx.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

Intellia Therapeutics 由CRISPR技术核心发明人詹妮弗·杜德纳联合创立，是全球首家开展体内CRISPR基因编辑临床试验的企业，其针对转甲状腺素蛋白淀粉样变性的候选疗法NTLA-2001在2021年发布的临床数据显示，单次静脉输注可显著降低患者体内致病蛋白水平，相关进展发表于《新英格兰医学杂志》。^{3535CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosisnejm.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

国内CRISPR生物技术企业邦耀生物于2022年公布了针对β-地中海贫血的CRISPR基因编辑疗法的初步临床数据，显示患者脱离输血依赖的时长达到行业领先水平，是国内首批推进CRISPR编辑造血干细胞疗法进入注册临床试验的本土企业。^{4545邦耀生物公布地中海贫血基因疗法临床数据，多例患者实现治愈thepaper.cn前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

2024年全球CRISPR基因编辑相关上市企业的总市值规模较2020年峰值出现明显回落，部分早期管线估值泡沫破裂，产业资本开始向具备明确临床验证数据和商业化落地路径的头部企业集中。^{4646CRISPR Therapeutics 2024年第一季度产业更新报告genomeweb.com前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

美国的CRISPR专利布局核心围绕核心基础专利的排他性持有展开，核心专利权主要由博德研究所、哈佛大学、麻省理工学院共同控制的CRISPR Therapeutics、Editas Medicine等关联实体持有，专利覆盖范围聚焦真核细胞编辑这一高价值应用场景，专利诉讼的最终裁定进一步巩固了美国主体在高等生物编辑领域的专利优势。^{4747CRISPR 专利全球格局分析报告wipo.int前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

欧盟地区的CRISPR专利布局呈现分散化特征，除了加州大学团队持有的部分基础专利在欧获得授权外，欧洲本土科研机构如亥姆霍兹协会、马克斯·普朗克研究所也围绕CRISPR的改良工具、递送系统等细分方向布局了大量应用类专利，整体专利体系更侧重农业、微生物编辑等非人体临床场景的权益划分。^{4747CRISPR 专利全球格局分析报告wipo.int前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

不同国家和地区的CRISPR专利审查标准存在明显差异，美国专利商标局对真核细胞编辑方法的专利授权持相对开放态度，而欧洲专利局曾一度驳回部分针对植物的CRISPR编辑专利申请，后续才逐步调整审查规则，中国国家知识产权局则明确将CRISPR技术相关的符合专利法要求的生物育种方法纳入授权范围。^{4747CRISPR 专利全球格局分析报告wipo.int前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

中国在2020年正式施行的《生物安全法》以及后续配套的《人类遗传资源管理条例实施细则》中，明确将人类生殖系基因编辑的临床应用列为严格管控的高风险生物医学活动，违规开展相关操作的主体将面临最高额度的行政处罚乃至刑事责任追究。^{4848中华人民共和国生物安全法npc.gov.cn前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

中国将CRISPR基因编辑临床应用纳入《生物医学新技术临床应用管理条例》监管框架，明确体细胞基因编辑临床研究属于高风险生物医学新技术，必须通过国家级卫生健康主管部门的伦理审查和临床研究审批后方可开展，不得未经许可擅自启动人体试验。^{4949生物医学新技术临床应用管理条例（征求意见稿）nhc.gov.cn前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

2012年8月17日，珍妮弗·杜德纳（Jennifer A. Doudna）与埃玛纽埃尔·沙尔庞捷（Emmanuelle Charpentier）领衔的研究团队在《Science》发表题为《A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity》的里程碑论文，首次在体外证实CRISPR-Cas9系统可以通过人工设计的向导RNA靶向切割特定双链DNA。^{22A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunityscience.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

该论文首次提出将天然细菌CRISPR系统中的两条独立RNA（tracrRNA与crRNA）改造为单链向导RNA（sgRNA）的简化方案，证明仅需Cas9蛋白与人工设计的sgRNA两个核心组分，即可完成对靶标DNA的精准定点切割，为后续将该系统移植到真核细胞中实现基因编辑提供了核心理论与技术依据。^{22A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunityscience.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

该研究成果发布前，学界已发现CRISPR是细菌的适应性免疫机制，但尚未明确其能否被改造为可编程的通用基因编辑工具，这篇论文的发表直接打破了此前锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）系统操作复杂、成本高昂的技术瓶颈，为后续CRISPR在真核生物中的编辑应用铺平了道路。^{22A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunityscience.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

2020年10月7日，瑞典皇家科学院宣布将诺贝尔化学奖授予德国马克斯·普朗克病原学研究所的埃玛纽埃尔·沙尔庞捷（Emmanuelle Charpentier）与美国加州大学伯克利分校的珍妮弗·杜德纳（Jennifer A. Doudna），以表彰二人在开发CRISPR-Cas9基因编辑技术上做出的决定性贡献。^{5050The Nobel Prize in Chemistry 2020nobelprize.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

该奖项是诺贝尔化学奖历史上首次由两位女性科学家共同获得，颁奖委员会明确指出CRISPR-Cas9技术能够精准修改实验动物、植物和微生物的DNA序列，为生命科学领域带来了革命性影响。^{5050The Nobel Prize in Chemistry 2020nobelprize.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}

此次诺贝尔化学奖的颁发正式将CRISPR基因编辑技术从小众的微生物学研究领域推至全球公众视野的核心位置，直接推动了后续数年全球范围内 CRISPR基因治疗 管线的商业化落地与监管审批提速。^{5050The Nobel Prize in Chemistry 2020nobelprize.org前往参考资料 ↓在新标签页中打开}